實(shí)驗(yàn)要點(diǎn)及說(shuō)明：
1．本方法適用于貼壁細(xì)胞培養(yǎng)，而不適用于懸浮細(xì)胞培養(yǎng)，懸浮細(xì)胞可使用滴片法；
2．所使用的蓋玻片應(yīng)該為優(yōu)質(zhì)玻璃，并經(jīng)過(guò)鉻酸洗液處理；
3．蓋玻片非常薄，易碎，取放蓋玻片時(shí)動(dòng)作要輕；
4．如果需要更多生長(zhǎng)狀態(tài)一致的細(xì)胞，可以使用較大的培養(yǎng)皿，但不宜過(guò)大，以避免培養(yǎng)液的浪費(fèi)和增加污染機(jī)率；
5．如果細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)能力較差，可將蓋玻片在0.5%多聚賴(lài)氨酸溶液中浸泡5-10分鐘并自然晾干。
公司細(xì)胞廣泛用于國(guó)內(nèi)院校的細(xì)胞生物學(xué)研究，作為實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目研究。下列產(chǎn)品詳細(xì)介紹：
產(chǎn)品名稱(chēng) | 生長(zhǎng)特性 | 貨號(hào) |
有袋大鼠腎細(xì)胞；PtK1(NBL-3) | 貼壁生長(zhǎng) | EY-X63515 |
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細(xì)胞名稱(chēng) 有袋大鼠腎細(xì)胞；PtK1(NBL-3)
形態(tài)特性: 上皮樣
生長(zhǎng)特性: 貼壁生長(zhǎng)
特征特性: 1962年，K.H.Walen從表觀正常的有袋大鼠的腎建立了PtK1細(xì)胞株。免疫過(guò)氧化物染色顯示角蛋白陽(yáng)性。
培養(yǎng)條件: MEM-EBSS:MinimumEssentialMedium(MEMEagleswithEarle'sBalancedSalts)優(yōu)質(zhì)胎牛血清，10%
傳代方法: 消化3-5分鐘。1:2。3天內(nèi)可長(zhǎng)滿。
傳代情況: PN5
凍存條件: 基礎(chǔ)培養(yǎng)基+8%DMSO+20%FBS
支原體檢測(cè): 陰性
冷凍保存細(xì)胞之方法
冷凍保存方法一: 冷凍管置于4℃ 30~60 分鐘→ （-20 ℃30 分鐘*） → -80 ℃16~18 小時(shí)（或隔夜） → 液氮槽vaporphase 儲(chǔ)存。
冷凍保存方法二: 冷凍管置于已設(shè)定程序之可程序降溫機(jī)中每分鐘降1-3 ℃ 至–80 ℃ 以下， 再放入液氮槽vapor phase儲(chǔ)存。*-20 ℃不可超過(guò)1 小時(shí)， 以防止冰晶過(guò)大，造成細(xì)胞大量死亡，亦可跳過(guò)此步驟直接放入-80℃ 冰箱中，惟存活率稍微降低一些。
實(shí)驗(yàn)報(bào)告：
一、分離與培養(yǎng)：
1、無(wú)菌條件下，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織，然后用PBS將此組織塊清洗2次，將成1mm3左右大小；
2、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型膠原酶），混懸10s，置37℃條件下消化10min，之后用滴管吹打制成單細(xì)胞懸液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培養(yǎng)基終止消化后4℃放置；
3、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液，混懸10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并終止消化后4℃放置，重復(fù)此步驟2-3次，直至組織*被消化；
4、用200目不銹鋼篩網(wǎng)過(guò)濾細(xì)胞消化液，1200r/min 離心10min，棄去上清，沉淀細(xì)胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養(yǎng)基混懸，接種于25cm2培養(yǎng)瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
5、差速貼壁1h后，吸出培養(yǎng)基，按實(shí)驗(yàn)需要接種于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)；
二、免疫熒光鑒定：
1、待心房肌細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合時(shí)，棄去培養(yǎng)基，用溫育的PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細(xì)胞15min；
2、PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后在4℃條件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；
3、PBS沖洗細(xì)胞2次，每次10min，然后在室溫條件下，用4% BSA封閉細(xì)胞30min；
4、按1: 100的比例稀釋α-actin一抗，然后將其放在4℃冰箱中孵育細(xì)胞過(guò)夜；
5、PBS沖洗細(xì)胞3次，每次10min，按1：150的比例稀釋抗α-actin的二抗， 37℃條件下放置1h；
6、用PBS沖洗3次，每次10min，在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像并拍照。
操作步驟:
1、貼壁細(xì)胞的消化
①吸除培養(yǎng)液，用無(wú)菌 PBS、Hanks 液或無(wú)血清培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞一次，以去除殘余的血清。
②加入少量 源葉生物 Trypsin-EDTA solution，略蓋過(guò)細(xì)胞即可，室溫放置 0.5～2min， 不同的細(xì)胞消化時(shí)間有所不同。
③顯微鏡下觀察，細(xì)胞明顯收縮，并且肉眼觀察培養(yǎng)器皿底部發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生明顯的變
化；或者用槍吹打細(xì)胞發(fā)現(xiàn)細(xì)胞剛好可以被吹打下來(lái)，吸除細(xì)胞消化液。加入含血清的 *細(xì)胞培養(yǎng)液，吹打下細(xì)胞，即可直接用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
④如果發(fā)現(xiàn)消化不足，則加入 Trypsin-EDTA solution 重新消化。
⑤如果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞消化時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，未及吹打細(xì)胞，細(xì)胞已經(jīng)有部分直接從培養(yǎng)器皿底部脫落， 直接用細(xì)胞培養(yǎng)液把細(xì)胞全部吹打下來(lái)。1000～2000g 離心 1min，沉淀細(xì)胞，盡量去除細(xì)胞消化液后，加入含血清的*培養(yǎng)液重新懸浮細(xì)胞，即可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
2、組織的消化不同的組織需要消化的時(shí)間相差很大，通常以消化后可以充分打散組織為宜。
Homo sapiens, human細(xì)胞名稱(chēng): 小鼠雜交瘤細(xì)胞；3H8H10 RPMI1640(w/oHepes)10%FBS
Saccharomyces cerevisiae Meyen ex E.C. Hans ..細(xì)胞名稱(chēng): 小鼠雜交瘤細(xì)胞；2H7 RPMI1640(w/oHepes)10%FBS
Aureobasidium pullulans (de Bary) Arnaud細(xì)胞名稱(chēng): 皰疹病單抗雜交瘤細(xì)胞；C5Mcab RPMI1640(w/oHepes)10%FBS
freeze-dried細(xì)胞名稱(chēng): 小鼠雜交瘤細(xì)胞；1F8G5D6D2 RPMI1640(w/oHepes)10%FBS
Saccharomyces cerevisiae Meyen ex E.C. Hans ..細(xì)胞名稱(chēng): 小鼠雜交瘤細(xì)胞；2A3 RPMI1640(w/oHepes)10%FBS
Phytophthora megasperma f. sp.medicagini ..細(xì)胞名稱(chēng): 小鼠雜交瘤細(xì)胞；IE6-A2 RPMI1640(w/oHepes)10%FBS
Flexibacter tractuosus (Lewin) Leadbetter細(xì)胞名稱(chēng): 抗人大腸癌單抗雜交瘤細(xì)胞；CYL-1 RPMI1640(w/oHepes)10%FBS
Hyphodontia subalutacea (Karsten) Eriksson細(xì)胞名稱(chēng): 抗人大腸癌單抗雜交瘤細(xì)胞；CYL-4 RPMI1640(w/oHepes)10%FBS
freeze-dried細(xì)胞名稱(chēng): 抗人大腸癌單抗雜交瘤細(xì)胞；CYL-2 RPMI1640(w/oHepes)10%FBS
Saccharomyces cerevisiae Meyen ex E.C. Hanse ..細(xì)胞名稱(chēng): 抗人大腸癌單抗雜交瘤細(xì)胞；CYL-3 RPMI1640(w/oHepes)10%FBS
Saccharomyces cerevisiae Meyen ex E.C. Hans ..細(xì)胞名稱(chēng): 抗人大腸癌單抗雜交瘤細(xì)胞；CYL-5 RPMI1640(w/oHepes)10%FBS
frozen細(xì)胞名稱(chēng): 小鼠雜交瘤細(xì)胞；1H7F8C12E5 RPMI1640(w/oHepes)10%FBS
frozen細(xì)胞名稱(chēng): 小鼠雜交瘤細(xì)胞；1D5H12F11F8 RPMI1640(w/oHepes)10%FBS
Bacillus licheniformis (Weigmann) Chester細(xì)胞名稱(chēng): 小鼠雜交瘤細(xì)胞；3D10 RPMI1640(w/oHepes)10%FBS
Saccharomyces cerevisiae Meyen ex E.C. Hans ..細(xì)胞名稱(chēng): 抗人pirin單抗雜交瘤細(xì)胞；IIIA3bC1E12D1 RPMI1640(w/oHepes)10%FBS
Saccharomyces cerevisiae Meyen ex E.C. Hans ..細(xì)胞名稱(chēng): 抗人EIFIAY單抗雜交瘤細(xì)胞；B4B5C5 RPMI1640(w/oHepes)10%FBS
有袋大鼠腎細(xì)胞；PtK1(NBL-3)人載脂蛋白E(Apo-E)ELISA試劑盒PAELISAKit產(chǎn)品規(guī)格:48T/96T。
人血小板膜糖蛋白Ⅳ(GP-Ⅳ)ELISA試劑盒PAELISAKit產(chǎn)品規(guī)格:48T/96T。
人心鈉肽(ANP)ELISA試劑盒PAELISAKit產(chǎn)品規(guī)格:48T/96T。
人FMS樣酪氨激酶3配體(Flt-3L)ELISA試劑盒PCPELISAKit產(chǎn)品規(guī)格:48T/96T。
人FMS樣酪氨激酶3(Flt3)ELISA試劑盒PCTELISAKit產(chǎn)品規(guī)格:48T/96T。
人型纖溶酶原激活物(uPA)ELISA試劑盒PCTELISAKit產(chǎn)品規(guī)格:48T/96T。
人型纖溶酶原激活物受體(PLAUR/uPAR)ELISA試劑盒PCXELISAKit產(chǎn)品規(guī)格:48T/96T。
人肌激酶同工酶MB(CK-MB)ELISA試劑盒PDELISAKit產(chǎn)品規(guī)格:48T/96T。
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